葡萄的品质容易受到低温胁迫的影响，而耐寒性强的野生山葡萄（Vamurensis）中的冷响应基因及其调控机制是葡萄遗传改良的核心。WRKY转录因子在冷胁迫响应中扮演着至关重要的角色，它通过结合W-box元件来调节次生代谢和碳水化合物合成等过程。

在葡萄中，VaWRKY65能够激活β-淀粉酶（VaBAM3），将淀粉分解为可溶性糖，这一过程对于调节渗透压、稳定细胞结构有重要意义。同时，VaWRKY65还可以直接调控过氧化物酶（VaPOD36），以清除活性氧（ROS），从而增强植物的耐寒性。然而，VaWRKYs在葡萄耐寒性中的具体功能和机制仍需进一步探讨。

在近期发表在《Horticulture Research》上的一项研究中，研究人员发现VaWRKY65在冷胁迫下通过调控碳水化合物代谢和抗氧化机制显著增强了葡萄的耐寒性。具体而言，VaWRKY65激活VaBAM3，促进可溶性糖的积累，从而调节渗透压；此外，它还激活VaPOD36的转录，以增加活性氧（ROS）的清除，进而提供双重的耐寒保护。

研究表明，通过在烟草叶片中瞬时表达由VaBAM3启动子驱动的荧光素酶（LUC）报告基因，科学家们检测到VaBAM3启动子在冷处理下的活性显著增加。研究进一步通过酵母单杂交筛选法和双荧光素酶报告基因分析，揭示了VaBAM3在冷胁迫下的调控机制。结果显示，VaWRKY65通过增强VaBAM3启动子的活性来提升耐寒性，而启动子的突变则会抑制这一增强作用。

此外，研究也揭示了VaWRKY65在冷胁迫下对ROS的调控机制。结果表明，VaWRKY65通过结合并激活VaPOD36的表达，从而上调VaPOD36，增强POD酶的活性，提升抗氧化能力，减少ROS的积累，最终提高植物的耐寒性。

此项研究的实验方法简述如下：研究人员将启动子片段与pGreenII-0800-LUC载体融合后转入根瘤农杆菌GV3101，再将其或空载体转入本氏烟草叶片。通过共培养2天后，进行了低温处理72小时（4℃）。在观察LUC荧光时，五分钟内喷洒1mM D-荧光素溶液，并利用勤翔IVScope7000植物活体成像系统检测发光数据。

通过这些发现，尊龙凯时希望为葡萄及其他植物的耐寒性改良提供新的研究方向，进而推动生物医疗和农业的可持续发展，以应对未来气候变化带来的挑战。