IPS诱导肠类器官的培养可以大致分为三个主要阶段：人多能干细胞（hPSC）的培养、内胚层分化与中/后肠模式化诱导，以及最终的类器官培养。本文将重点介绍第一阶段——人多能干细胞的培养。

一、实验准备

1. 人多能干细胞培养基的配置

(1) 将hPSC Medium Supplement在2-8℃解冻，融化后轻轻上下摇动混匀，按实际需求分装，立即使用或储存于-20~-80℃以防止反复冻融。

(2) 按1:50的比例添加hPSC Medium Supplement（10 mL）至hPSC Medium Basal Medium（500 mL）中，混合均匀后即得人多能干细胞培养基（abs9403）。注意：混合后的人多能干细胞培养基可在2-8℃存放2-3周，建议不使用超过3周的培养基。

(3) 实验试剂的平衡：在实验前，将人多能干细胞培养基放置于室温避光下平衡；PBS及消化液需加热至37℃。注意：培养基中的活性因子不应在37℃水浴中加热。

二、操作方法

以下所有步骤应在无菌条件下进行。

复苏hPSC细胞

1. 实验步骤：

1.1 基质胶包被培养板：取出6孔板或12孔板，每孔加入1 mL或0.5 mL基质胶（abs9410），轻轻晃动使其均匀覆盖培养皿底部，置于37℃培养箱中孵育1-2小时。使用前需在超净工作台中室温平衡20分钟。如暂时不使用，可用Parafilm封口后在2-8℃储存，1周内使用。

注意：一支冻存的干细胞大约为1×10⁶ cells/mL，适合6孔板中的一个孔；基质胶温度敏感，使用后应立即放回4℃冰箱并避免直接触碰基质胶液面。

1.2 预备干细胞培养基：取2-3 mL干细胞培养基加入15 mL离心管中待用。

1.3 解冻细胞：将冻存管从液氮中取出，迅速浸入37℃温水中，快速摇动以在1-2分钟内解冻。注意：需迅速减少细胞在室温中的暴露时间。

1.4 离心处理：解冻后将冻存液逐滴加入含有干细胞培养基的15 mL离心管中，低速离心1000 rpm 3分钟。

1.5 重悬细胞：离心后弃去上清，加1 mL人多能干细胞培养基对细胞沉淀进行吹吸混匀，吹吸3-5次。

1.6 接种细胞：将均匀的细胞悬液加入包被好的6孔板，每孔补全至2 mL培养体系。

1.7 培养：接种后的6孔板可在倒置相差显微镜下观察细胞密度及团块大小，要求出现4个细胞以上的团块为合格。轻轻晃动以使细胞均匀分布，置于37℃、5% CO₂恒温培养箱中培养，次日观察细胞贴壁情况。

1.8 换液：复苏后每24小时更换新鲜培养基，因培养基活性成分仅足够维持一天。

hPSC细胞传代

2. 实验步骤：

2.1 清洗：吸去旧培养基，缓慢加入1 mL PBS缓冲液并轻轻晃动后沿皿边吸走。

2.2 消化：在6孔板中加入2 mL人多能干细胞消化液（abs9409），覆盖皿底，置于37℃培养箱中2-5分钟。

注意：消化时间视细胞生长密度而定，通常建议时间在2-5分钟，观察消化情况并及时终止消化。

2.3 吹打处理：吸掉消化液后，加入2 mL人多能干细胞培养基，轻柔吹打3-5次，将细胞转移至15 mL离心管中。

注意：吹打时动作需轻柔，避免形成单细胞。

2.4 离心：以1000 rpm离心3分钟，弃去上清。

2.5 接种细胞：用干细胞培养基轻柔吹打细胞，加入培养板并补全至每孔2 mL。

2.6 换液：传代后每24小时换液一次，确保细胞得到新鲜的培养基。

hPSC细胞冻存

3. 实验步骤：

3.1 清洗、消化、吹打、离心：步骤同上。

3.2 重悬细胞：添加2 mL ES/iPS细胞冻存液（abs9412）并混匀，将细胞加入冻存管中。

注意：冻存液应即用即取，及时放回4℃冰箱。

3.3 记录信息：在冻存管上标记细胞种类、时间、操作者及细胞批次。

3.4 冻存：将冻存管竖直放置于-80℃冰箱过夜，之后转移至液氮中进行长期冻存。

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